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Nano-LeuchtballonsFluoreszenz-Immunoliposomen
Wenn man Antikörper mit zu viel Fluoreszenz-Ballast belädt, verändern sie ihre Eigenschaften. Wie man trotzdem 500 Chromophore auf einem Antikörper unterbringen kann ohne ihn zu behindern, erklärt ein Spezialist für Fluoreszenzfarbstoffe. Antiköper sind unverzichtbare Werkzeuge in der biochemischen Analytik und medizinischen Diagnostik; aber so vielseitig wie sie auch sein mögen, ganz ohne Makel sind auch Antikörper nicht. So ist man mit ihnen an wässrige Phasen gebunden, der gewählte Temperaturbereich ist eine Gratwanderung zwischen Denaturierung und Reaktionsträgheit, und allgegenwärtige Proteasen nehmen auch Antikörper ins Visier und können ganze Tests unbrauchbar machen. Das Hauptproblem ist jedoch die schwierige Detektion einzelner Antikörper. Bei den etablierten Tests verknüpft man die Antikörper häufig mit Enzymen, zum Beispiel Meerrettichperoxidase (HPR) und lokalisiert sie nachfolgend über eine Redox-Farbreaktion. Allerdings ist die Detektion der Antikörper dadurch nur indirekt, weil die Farbstoffe keinerlei Verbindung zu den Antikörpern haben.Zu viel Ballast Um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, verknüpfen Analytiker die Antikörper mit fluoreszierenden Molekülen (Tracern); bekanntestes Beispiel in der Biochemie ist das Grün-Flureszierende-Protein (GFP). Wegen der hohen Molekulargewichte von Antikörpern benötigt man für die visuelle Detektion aber verhältnismäßig viel Material und nur mit erheblichem Messaufwand gelingt es dann, einzelne Antikörper und deren Bindungsstellen zu lokalisieren. Will man einzelne Antikörper visuell lokalisieren, muss man das Fluoreszenzsignal verstärken und die Antikörper statt mit nur einem Fluorophor mit vielen verbinden. Ein klassisches Beispiel ist das Paar Biotin/Streptavidin, über das sich eine Vielzahl an Chromophoren einbauen lässt (King-Keung Sin et al. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 638–644). Durch die direkte Verknüpfung mit Chromophoren belädt man die Antikörper aber mit immer mehr Ballast, bis sie schließlich ihre Eigenschaften ändern und das Anhängsel auch andere Eigenschaften dominiert, etwa die Tendenz zur Aggregation und die dadurch bedingte Konzentrations-Fluoreszenzlöschung (bei höheren Konzentrationen an Fluorophoren tritt häufig im Vergleich zu verdünnteren Systemen eine Abnahme der Fluoreszenz auf). Besser wäre es, vom Antikörper aus eine einzelne flexible Verbindung zu einer stark fluoreszierenden Einheit herzustellen, so dass der Antikörper wie an einem Seil mit dieser verbunden ist. Die Verbindungsstelle sollte die Bindungs-Eigenschaften des Antikörpers möglichst nicht beeinflussen. Bringt man viele Chromophore in einem solchen „Leuchtballon“ unter, erreicht dieser Nanometer-Dimensionen. Wir haben bereits Anfang der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts, als noch niemand etwas mit den Begriffen Nanotechnologie oder Einzelmolekülspektroskopie anfangen konnte, an der LMU München (Arbeitsgruppe Heinz Langhals) ein System entwickelt, das diese Vorgaben erfüllt (H. Schott et al., Biochim. Biophys. Acta 1992, 1110, 151-157; R. A. Schwendener et al., Biochim. Biophys. Acta 1990, 1026, 69-79).Liposomen erste Wahl Das Material dieses Nano-Leuchtballons musste mit Wasser und dem Antikörper verträglich sein und die Aufnahme von vielen Chromophoren gestatten, ohne eine Konzentrationslöschung auszulösen. Liposomen erschienen uns hierfür als besonders gut geeignet, weil ihre Lipid-Doppelschicht der Zellmembran ähnelt und ihre Größe zu anderen analytischen Randbedingungen passte. Zunächst dachten wir daran, die Vakuole der Liposomen mit Fluoreszenzfarbstoffen zu füllen. Dies hat aber zwei Nachteile: Erstens schlüpfen kleine Moleküle durch die Lipid-Doppelschicht der Liposomen, so dass diese langsam „ausbluten“ und stabile analytische Titer nicht möglich sind. Zweitens ist die Vakuole durch die Fluoreszenzfarbstoffe blockiert, so dass man keine weiteren Substanzen, zum Beispiel Wirkstoffe, mit dem Antikörper transportieren kann. Wir entschlossen uns deshalb, die Lipid-Doppelschicht mit Fluoreszenfarbstoffen zu markieren, die wir über unverzweigte aliphatische Reste passgenau in der Doppelschicht verankerten. Bei der Detektion wird der Fluoreszenzfarbstoff sehr hohen Anregungslicht-Dosen ausgesetzt, so dass man außergewöhnlich stabile Chromophore benötigt. Wir benutzten deshalb Perylenfarbstoffe (1), die zu den lichtechtesten Fluoreszenzfarbstoffen überhaupt gehören, und verknüpften deren Stickstoffatome mit langkettigen sekundären-Alkylresten die der Struktur der Lipid-Doppelschicht nachempfunden sind (dieses Substitutionsmuster erhöht zudem die Löslichkeit der ansonsten sehr schwerlöslichen Perylenfarbstoffe). Prinzipiell kann man die beiden sec-n-Alkylrest-Zweige gleich- oder unterschiedlich lang wählen; in letzterem Fall entstehen jedoch stereogene Zentren und damit schwer zu trennende Diastereomerenpaare.
Wenn man Antikörper mit zu viel Fluoreszenz-Ballast belädt, verändern sie ihre Eigenschaften. Wie man trotzdem 500 Chromophore auf einem Antikörper unterbringen kann ohne ihn zu behindern, erklärt ein Spezialist für Fluoreszenzfarbstoffe. Antiköper sind unverzichtbare Werkzeuge in der biochemischen Analytik und medizinischen Diagnostik; aber so vielseitig wie sie auch sein mögen, ganz ohne Makel sind auch Antikörper nicht. So ist man mit ihnen an wässrige Phasen gebunden, der gewählte Temperaturbereich ist eine Gratwanderung zwischen Denaturierung und Reaktionsträgheit, und allgegenwärtige Proteasen nehmen auch Antikörper ins Visier und können ganze Tests unbrauchbar machen. Das Hauptproblem ist jedoch die schwierige Detektion einzelner Antikörper. Bei den etablierten Tests verknüpft man die Antikörper häufig mit Enzymen, zum Beispiel Meerrettichperoxidase (HPR) und lokalisiert sie nachfolgend über eine Redox-Farbreaktion. Allerdings ist die Detektion der Antikörper dadurch nur indirekt, weil die Farbstoffe keinerlei Verbindung zu den Antikörpern haben.Zu viel Ballast Um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, verknüpfen Analytiker die Antikörper mit fluoreszierenden Molekülen (Tracern); bekanntestes Beispiel in der Biochemie ist das Grün-Flureszierende-Protein (GFP). Wegen der hohen Molekulargewichte von Antikörpern benötigt man für die visuelle Detektion aber verhältnismäßig viel Material und nur mit erheblichem Messaufwand gelingt es dann, einzelne Antikörper und deren Bindungsstellen zu lokalisieren. Will man einzelne Antikörper visuell lokalisieren, muss man das Fluoreszenzsignal verstärken und die Antikörper statt mit nur einem Fluorophor mit vielen verbinden. Ein klassisches Beispiel ist das Paar Biotin/Streptavidin, über das sich eine Vielzahl an Chromophoren einbauen lässt (King-Keung Sin et al. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 638–644). Durch die direkte Verknüpfung mit Chromophoren belädt man die Antikörper aber mit immer mehr Ballast, bis sie schließlich ihre Eigenschaften ändern und das Anhängsel auch andere Eigenschaften dominiert, etwa die Tendenz zur Aggregation und die dadurch bedingte Konzentrations-Fluoreszenzlöschung (bei höheren Konzentrationen an Fluorophoren tritt häufig im Vergleich zu verdünnteren Systemen eine Abnahme der Fluoreszenz auf). Besser wäre es, vom Antikörper aus eine einzelne flexible Verbindung zu einer stark fluoreszierenden Einheit herzustellen, so dass der Antikörper wie an einem Seil mit dieser verbunden ist. Die Verbindungsstelle sollte die Bindungs-Eigenschaften des Antikörpers möglichst nicht beeinflussen. Bringt man viele Chromophore in einem solchen „Leuchtballon“ unter, erreicht dieser Nanometer-Dimensionen. Wir haben bereits Anfang der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts, als noch niemand etwas mit den Begriffen Nanotechnologie oder Einzelmolekülspektroskopie anfangen konnte, an der LMU München (Arbeitsgruppe Heinz Langhals) ein System entwickelt, das diese Vorgaben erfüllt (H. Schott et al., Biochim. Biophys. Acta 1992, 1110, 151-157; R. A. Schwendener et al., Biochim. Biophys. Acta 1990, 1026, 69-79).Liposomen erste Wahl Das Material dieses Nano-Leuchtballons musste mit Wasser und dem Antikörper verträglich sein und die Aufnahme von vielen Chromophoren gestatten, ohne eine Konzentrationslöschung auszulösen. Liposomen erschienen uns hierfür als besonders gut geeignet, weil ihre Lipid-Doppelschicht der Zellmembran ähnelt und ihre Größe zu anderen analytischen Randbedingungen passte. Zunächst dachten wir daran, die Vakuole der Liposomen mit Fluoreszenzfarbstoffen zu füllen. Dies hat aber zwei Nachteile: Erstens schlüpfen kleine Moleküle durch die Lipid-Doppelschicht der Liposomen, so dass diese langsam „ausbluten“ und stabile analytische Titer nicht möglich sind. Zweitens ist die Vakuole durch die Fluoreszenzfarbstoffe blockiert, so dass man keine weiteren Substanzen, zum Beispiel Wirkstoffe, mit dem Antikörper transportieren kann. Wir entschlossen uns deshalb, die Lipid-Doppelschicht mit Fluoreszenfarbstoffen zu markieren, die wir über unverzweigte aliphatische Reste passgenau in der Doppelschicht verankerten. Bei der Detektion wird der Fluoreszenzfarbstoff sehr hohen Anregungslicht-Dosen ausgesetzt, so dass man außergewöhnlich stabile Chromophore benötigt. Wir benutzten deshalb Perylenfarbstoffe (1), die zu den lichtechtesten Fluoreszenzfarbstoffen überhaupt gehören, und verknüpften deren Stickstoffatome mit langkettigen sekundären-Alkylresten die der Struktur der Lipid-Doppelschicht nachempfunden sind (dieses Substitutionsmuster erhöht zudem die Löslichkeit der ansonsten sehr schwerlöslichen Perylenfarbstoffe). Prinzipiell kann man die beiden sec-n-Alkylrest-Zweige gleich- oder unterschiedlich lang wählen; in letzterem Fall entstehen jedoch stereogene Zentren und damit schwer zu trennende Diastereomerenpaare.
Issue #3
Title is badly formatted. It should be split in two lines or in a subtitle, as in my template.
- Accepted by admin
- Type of issue
- Rudimentary content not removed
- Reported
- Jun 18, 2017